Protocol ◆ cd16a-spr-kd
协议：CD16a SPR KD 测量——158V vs 158F 同场DRAFT
协议：CD16a SPR KD 测量——158V vs 158F 同场
> 草稿（DRAFT）——文献依据（待湿实验验证）。运行前请与平台科学家确认缓冲液与芯片兼容性。
目的
一次实验内测量测试 IgG1 对 CD16a 158V 与 158F 的 KD/kon/koff，并计算 ΔKD(158V/158F) ratio 用于 allotype 对比。
材料
- CD16a 158V + 158F（ECD，biotinylated，同源表达，allotype 经测序/质谱验证）
- Streptavidin 传感器/芯片（SPR 或 BLI）
- 运行缓冲液：PBS-T（10 mM 磷酸盐、150 mM NaCl、0.05% Tween-20，pH 7.4）
- 分析物：单体 IgG1（如 rituximab/trastuzumab，同一批次）；SEC 确认单体
- 对照：参照抗体（同批）、isotype IgG4（阴性对照）
操作步骤
- 低密度捕获：158V 与 158F 各一通道/传感器，biotinylated ECD 捕获；SPR 目标 Rmax 30–80 RU（BLI 0.3–0.8 nm）——防亲合性伪影；
- 平衡：PBS-T pH 7.4 至基线稳定（≥5 min）；
- 浓度系列：IgG1 2 倍稀释（覆盖预期 KD 上下 ~10×），≥5 浓度 + 0（对照）；
- 结合/解离：30–50 µL/min（SPR）或 100–200 rpm（BLI）；结合 120–180 s，解离 180–300 s；参考通道扣减；
- 再生：10 mM glycine pH 2.0–2.5 短脉冲（10–20 s）；先验证 ≥5 循环活性稳定；
- 分析：1:1 Langmuir 全局拟合 → KD/kon/koff（两 allotype 各自报告）；计算 ΔKD ratio = KD(158F)/KD(158V)。
判读
- 文献报道 158V 对 IgG1 亲和力约为 158F 的 2–5×——你的 ΔKD ratio 应与 datasheet 同数量级，否则查密度/批次；
- 记录绝对 KD 与 ratio；跨实验固定表达系统（HEK293 vs CHO 影响结合）。
故障排查
| 症状 | 原因 | 修复 |
|---|---|---|
| 两 allotype 无差异 | 密度过高掩盖差异/批次混淆 | 降密度；确认 allotype 验证 |
| KD 偏紧 | 密度/二聚 | 低密度；SEC 纯化分析物 |
| 基线漂移 | 再生不足 | 加强再生；验证循环稳定 |
参考文献
- Koene HR, Kleijer M, Algra J, Roos D, von dem Borne AE, de Haas M. FcγRIIIa-158V/F polymorphism influences the binding of IgG by natural killer cell FcγRIIIa, independently of the FcγRIIIa-48L/R/H phenotype. *Blood.* 1997;90(3):1109–1114.
- Wu J, Edberg JC, Redecha PB, et al. A novel polymorphism of FcγRIIIa (CD16) alters receptor function and predisposes to autoimmune disease. *J Clin Invest.* 1997;100(5):1059–1070.
相关
- [CD16a variant 选择指南](/content/cd16a-variant-guide)
- [CD16a 158V vs 158F 对比设计](/content/cd16a-158v-158f-comparison)
- [CD16a Hub](/hub/cd16a)
下一步
- [购买 CD16a 158V & 158F](/request?utm_campaign=cd16a-spr-kd&utm_source=site&utm_medium=organic&utm_content=cta-buy) — allotype 验证、参照抗体 KD
- [咨询实验设计](/request?utm_campaign=cd16a-spr-kd&utm_source=site&utm_medium=organic&utm_content=cta-discuss) — 密度与 ΔKD 判读支持