Protocol ◆ cd47-sirpa-spr-blocking
协议：CD47–SIRPα SPR 结合与抗体阻断DRAFT
协议：CD47–SIRPα SPR 结合与抗体阻断
> 草稿（DRAFT）——文献依据（待湿实验验证）。低亲和相互作用（文献报道 µM 级）——本协议所有步骤围绕"防亲合性伪影"设计。
目的
测量 CD47–SIRPα 结合（KD/kon/koff）并证明抗 CD47 / 抗 SIRPα 阻断——吞噬项目的机制级证据。
材料
- CD47 ECD（IgV 或全长，SEC 单体确认）
- SIRPα V1 ECD（allotype 明确）
- Streptavidin 传感器/芯片（如需 biotinylated 捕获）
- 运行缓冲液：PBS-T pH 7.4 + 0.1% BSA
- 阻断试剂：anti-CD47 / anti-SIRPα；isotype 阴性对照
操作步骤（低密度关键）
- 极低密度捕获：CD47（或 SIRPα）捕获至 Rmax ≤ 20 RU（BLI ≤ 0.2 nm）——µM 级低亲和 + 快动力学，密度稍高即再结合伪影；
- 高流速：SPR ≥ 50 µL/min（BLI 200 rpm）——抑制传质限制；
- 浓度系列：分析物 2 倍稀释覆盖 µM 级（如 0.3–20 µM），≥5 浓度 + 0；结合 60–120 s，解离 60–120 s（快动力学，解离段短而密采样）；
- 再生：温和再生（高盐或 10 mM glycine pH 3.0 短脉冲）；验证循环稳定性；
- 竞争阻断：分析物预孵育抗体（如 anti-CD47 与 CD47 预孵育 → 注入 SIRPα）→ 信号下降 = 阻断；isotype 必须无阻断；
- 细胞验证衔接：SPR 证明机制后，用吞噬 assay（CD47 阴性细胞对照）确认功能——SPR 不能替代功能证据。
判读
- 报告 KD + kon/koff（µM 级属正常）；若测出 nM 级，先怀疑密度/二聚伪影；
- 阻断抑制率 = (1 − 信号/对照) × 100%；≥70% 为有效阻断（阈值按抗体而定，先与文献对照）；
- SIRPα V1 vs V2：临床相关确认抗体对两 allotype 的阻断。
故障排查
| 症状 | 原因 | 修复 |
|---|---|---|
| 测得 nM 级"亲和力" | 密度高/分析物二聚 | 降到 Rmax ≤20 RU；SEC 纯化 |
| 信号太小 | 低亲和本身 | 提高浓度上限（覆盖 µM）；捕获量至上限 |
| 阻断不彻底 | 表位/浓度 | 提高抗体浓度；换抗体 |
参考文献
- Oldenborg PA, Zheleznyak A, Fang YF, Lagenaur CF, Gresham HD, Lindberg FP. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. *Science.* 2000;288(5473):2051–2054.
- Barclay AN, Van den Berg TK. The interaction between signal regulatory protein alpha (SIRPα) and CD47: structure, function, and therapeutic target. *Annu Rev Immunol.* 2014;32:25–50.
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