Protocol ◆ tigit-cd155-bli
协议：TIGIT–CD155 BLI 结合与竞争DRAFT
协议：TIGIT–CD155 BLI 结合与竞争
> 草稿（DRAFT）——文献依据（待湿实验验证）。
目的
验证 TIGIT–CD155 配对结合（KD/kon/koff）并通过竞争实验确认抗体阻断——检查点筛选在信任 hits 前必须做的两个实验。
材料
- Biotinylated TIGIT（ECD）——捕获格式；CD155 ECD——分析物
- Streptavidin 生物传感器（BLI）或芯片（SPR）
- 运行缓冲液：PBS-T pH 7.4 + 0.1% BSA（防非特异）
- 分析物：CD155 ECD（SEC 确认单体/二聚状态）
- 阻断试剂：anti-TIGIT / anti-CD155 抗体；DNAM-1（CD226）对照
操作步骤
- 捕获：biotinylated TIGIT 低密度捕获（Rmax 20–50 RU / 0.2–0.5 nm）；
- 平衡：PBS-T+BSA 至基线稳定；
- 浓度系列：CD155 2 倍稀释（覆盖低 nM 级 KD），≥5 浓度 + 0；结合 180 s，解离 300 s；
- 再生：10 mM glycine pH 2.5–3.0 短脉冲（10–15 s）；验证 ≥5 循环活性；
- 竞争实验：CD155 与 anti-TIGIT（或 anti-CD155）预孵育 30 min → 注入 → 结合信号应显著下降；
- 交叉对照：CD155 与 DNAM-1 的结合对照（区分 TIGIT 特异性阻断 vs 配体封堵）。
判读
- 文献报道 TIGIT–CD155 KD 为低 nM 级；与 datasheet 差 10× 以上先查密度/缓冲液/二聚；
- 竞争抑制率 = (1 − 结合信号/对照) × 100%；记录抑制率与参照抗体对比；
- DNAM-1 对照：抗体不阻断 CD155–DNAM-1 → 仅阻断 TIGIT 通路（生物学不同，需报告）。
故障排查
| 症状 | 原因 | 修复 |
|---|---|---|
| 高非特异结合 | 无 BSA / 密度高 | 加 BSA；降密度 |
| KD 偏紧 | CD155 寡聚 | 查 COA SEC；用单体批次 |
| 竞争无信号变化 | 表位/浓度不足 | 提高抗体浓度；换抗体 |
参考文献
- Yu X, Harden K, Gonzalez LC, et al. The surface protein TIGIT suppresses T cell activation by promoting the generation of mature immunoregulatory dendritic cells. *Nat Immunol.* 2009;10(1):48–57.
- Stanietsky N, Simic H, Arapovic J, et al. The interaction of TIGIT with PVR and PVRL2 inhibits human NK cell cytotoxicity. *Proc Natl Acad Sci USA.* 2009;106(42):17858–17863.
- Bottino C, Castriconi R, Moretta L, et al. Identification of PVR (CD155) and Nectin-2 (CD112) as cell surface ligands for the human DNAM-1 (CD226) activating molecule. *J Exp Med.* 2003;198(4):557–567.
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