Protocol: CD47–SIRPα SPR Binding & Antibody Blocking

> DRAFT — 文献依据（待湿实验验证）。低亲和力相互作用（文献报道 µM 级）——本协议所有步骤围绕"防亲合性伪影"设计。

Objective

Measure CD47–SIRPα binding (KD, k_on, k_off) and demonstrate anti-CD47 / anti-SIRPα blockade — the mechanism-level evidence behind a phagocytosis program.

Materials

• CD47 ECD（IgV 或全长 ECD，SEC 单体确认）— 捕获或分析物均可
• SIRPα V1 ECD（allotype 明确）— 对应分析物/捕获
• Streptavidin sensor/chip（如需 biotinylated 捕获）
• Running buffer: PBS-T pH 7.4 + 0.1% BSA
• Blocking reagents: anti-CD47 / anti-SIRPα；isotype 阴性对照

Procedure（低密度关键）

• 极低密度捕获：CD47（或 SIRPα）捕获至 Rmax ≤ 20 RU（BLI ≤ 0.2 nm）——µM 级低亲和力 + 快动力学，密度稍高即出现再结合伪影。
• 高流速：SPR ≥ 50 µL/min（BLI 200 rpm 摇速）——抑制传质限制。
• 浓度系列：分析物 2 倍稀释系列覆盖 µM 级（如 0.3–20 µM），≥5 浓度 + 0；结合 60–120 s，解离 60–120 s（快动力学，解离段要短而密采样）。
• 再生：温和再生（高盐或 10 mM glycine pH 3.0 短脉冲）；验证循环稳定性。
• 竞争阻断：分析物预孵育抗体（如 anti-CD47 与 CD47 预孵育 → 注入 SIRPα）→ 信号下降 = 阻断；isotype 对照必须无阻断。
• 细胞验证衔接：SPR 证明机制后，用吞噬 assay（CD47 阴性细胞对照）确认功能——SPR 不能替代功能证据。

Interpretation

• 报告 KD + k_on/k_off（µM 级属正常）；若测出 nM 级，先怀疑密度/二聚伪影。
• 阻断抑制率 = (1 − 信号/对照) × 100%；≥70% 为有效阻断（阈值按抗体而定，先与文献对照）。
• SIRPα V1 vs V2：如需临床相关，确认抗体对两 allotype 的阻断。

Troubleshooting

References

• Oldenborg PA, Zheleznyak A, Fang YF, Lagenaur CF, Gresham HD, Lindberg FP. Role of CD47 as a marker of self on red blood cells. *Science.* 2000;288(5473):2051–2054.
• Barclay AN, Van den Berg TK. The interaction between signal regulatory protein alpha (SIRPα) and CD47: structure, function, and therapeutic target. *Annu Rev Immunol.* 2014;32:25–50.

Related

• [CD47/SIRPα 阻断实验三大陷阱](/content/cd47-sirpa-blocking)
• [CD47/SIRPα Hub](/hub/cd47-sirpa)

What next?

• [Buy CD47/SIRPα Matched Pair](/request?utm_campaign=cd47-sirpa-spr-blocking&utm_source=site&utm_medium=organic&utm_content=cta-buy) — 单体 ECD，SPR 数据
• [Discuss Your Experiment](/request?utm_campaign=cd47-sirpa-spr-blocking&utm_source=site&utm_medium=organic&utm_content=cta-discuss) — 低密度与 RBC 规避支持