Protocol ◆ cd16a-spr-kd
Protocol: CD16a SPR KD Measurement — 158V vs 158F Side by SideDRAFT
Protocol: CD16a SPR KD Measurement — 158V vs 158F Side by Side
> DRAFT — 文献依据（待湿实验验证）。运行前请与平台科学家确认缓冲液与芯片兼容性。
Objective
Measure KD / k_on / k_off of a test IgG1 against CD16a 158V and 158F in one session, and derive the ΔKD(158V/158F) ratio for allotype comparison.
Materials
- CD16a 158V + 158F（ECD，biotinylated，同源表达，allotype 经测序/质谱验证）
- Streptavidin sensor/chip（SPR 或 BLI）
- Running buffer: PBS-T (10 mM phosphate, 150 mM NaCl, 0.05% Tween-20, pH 7.4)
- Analyte: monomeric IgG1（如 rituximab/trastuzumab，同一批次）；SEC 确认单体
- Controls: 参照抗体（同批）、isotype IgG4（阴性对照）
Procedure
- 低密度捕获：158V 与 158F 各一通道/传感器，biotinylated ECD 捕获；SPR 目标 Rmax 30–80 RU（BLI 0.3–0.8 nm）——防亲合性伪影。
- 平衡：PBS-T pH 7.4 至基线稳定（≥5 min）。
- 浓度系列：IgG1 2 倍稀释系列（覆盖预期 KD 上下 ~10×），至少 5 个浓度 + 0（对照）。
- 结合/解离：30–50 µL/min（SPR）或 100–200 rpm（BLI）；结合 120–180 s，解离 180–300 s；参考通道扣减。
- 再生：10 mM glycine pH 2.0–2.5 短脉冲（10–20 s）；先验证 ≥5 循环活性稳定再跑正式系列。
- 分析：1:1 Langmuir 全局拟合 → KD / k_on / k_off（两 allotype 各自报告）；计算 ΔKD ratio = KD(158F)/KD(158V)（或亲和力比，注明口径）。
Interpretation
- 文献报道 158V 对 IgG1 亲和力约为 158F 的 2–5 倍——你的 ΔKD ratio 应与 datasheet 同数量级，否则查密度/批次。
- 记录绝对 KD 与 ratio；跨实验比较时固定表达系统（HEK293 vs CHO 影响结合）。
Troubleshooting
| 症状 | 原因 | 修复 |
|---|---|---|
| 两 allotype 无差异 | 密度过高（亲合性掩盖差异）/ 批次混淆 | 降低密度；确认 allotype 验证报告 |
| KD 偏紧 | 表面密度/二聚 | 低密度；SEC 纯化分析物 |
| 基线漂移 | 再生不足 | 强化再生；验证循环稳定性 |
References
- Koene HR, Kleijer M, Algra J, Roos D, von dem Borne AE, de Haas M. FcγRIIIa-158V/F polymorphism influences the binding of IgG by natural killer cell FcγRIIIa, independently of the FcγRIIIa-48L/R/H phenotype. *Blood.* 1997;90(3):1109–1114.
- Wu J, Edberg JC, Redecha PB, et al. A novel polymorphism of FcγRIIIa (CD16) alters receptor function and predisposes to autoimmune disease. *J Clin Invest.* 1997;100(5):1059–1070.
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