Protocol ◆ il15-nk-expansion-protocol
Protocol: IL-15 NK Expansion (PBMC-based, Research Grade)DRAFT
Protocol: IL-15 NK Expansion (PBMC-based, Research Grade)
> DRAFT — 文献依据（待湿实验验证）。浓度与节奏需按供体滴定；细胞治疗 GMP 流程需另按生产规范执行。
Objective
Expand NK cells from PBMC with IL-15 (± IL-21) and validate the cytokine lot's potency (ED50) — the protocol behind "IL-15 用于 NK expansion" content.
Materials
- IL-15（Animal-Free；COA 含 ED50）；IL-21（组合用，可选）
- PBMC（新鲜或冻存，供体一致性记录）
- NK 培养基（X-VIVO 15 / AIM-V 类，无血清或低血清，避免含干扰因子血清）
- 细胞计数/活力（Trypan blue 或流式）；表型抗体（CD56/CD16/CD3）
Procedure
- IL-15 滴定预实验：先做单供体浓度梯度（10 / 25 / 50 ng/mL）确定工作浓度（建议 10–50 ng/mL 起）。
- 接种：PBMC 接种于 24 孔/6 孔板，1–2×10⁶ cells/mL（NK 富集可选——一致性优先）。
- IL-15 添加：工作浓度 IL-15；IL-21 组合方案：第 0 天 IL-15，第 3–4 天起加 IL-21（10–30 ng/mL，文献范围）。
- 补加节奏：每 2–3 天补 IL-15（半衰期短，饥饿即凋亡）；视密度 50% 换液。
- 周期：7–14 天（终点固定：扩增倍数 + 活力 + CD56⁺/CD16⁺ 表型 + 杀伤 assay（K562 或靶细胞））。
- ED50 验证：同一批 IL-15 做增殖剂量-响应（如 CTLL-2 或 NK 增殖），确认 COA 的 ED50 在本实验体系可复现。
Interpretation
- 7–14 天 NK 扩增倍数依供体差异大（文献报道 5–50× 范围）——与文献对照，勿单次结论；
- 活力 >85%、CD56⁺ 比例上升为合格信号；只有数量没有功能 = 失败（杀伤 assay 必须做）；
- IL-15/IL-15Rα 复合物（sushi 域）可做平行对照，验证是否提升活性。
Troubleshooting
| 症状 | 原因 | 修复 |
|---|---|---|
| 无扩增 | 浓度过低/IL-15 失活/血清干扰 | 复测 ED50；换无血清培养基；提高浓度 |
| 前 3 天大量死亡 | 解冻损伤/无 feeder | 加 IL-15 更早；优化复苏 |
| 后期耗竭 | 周期过长/缺补加 | 缩短到 ≤14 天；每 2–3 天补加 |
| ED50 与 COA 不符 | 体系差异（细胞株/培养基） | 用标准细胞株复测；向供应商反馈 |
References
- Waldmann TA. The biology of interleukin-2 and interleukin-15: implications for cancer therapy and vaccine design. *Nat Rev Immunol.* 2006;6(8):595–601.
- Dubois S, Mariner J, Waldmann TA, Tagaya Y. IL-15Rα recycles and presents IL-15 in trans to neighboring cells. *Immunity.* 2002;17(5):537–547.
- Parrish-Novak J, Dillon SR, Nelson A, et al. Interleukin 21 and its receptor are involved in NK cell expansion and regulation of lymphocyte function. *Nature.* 2000;408(6808):57–63.
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