Technical Note ◆ fcRn-spr-protocol
分步操作：FcRn SPR 协议（pH 6.0 / 7.4 双缓冲切换）PUBLISHED
分步操作：FcRn SPR 协议（pH 6.0 / 7.4 双缓冲切换）
目的
测量 IgG/Fc 在 pH 6.0 对 FcRn 的结合与 pH 7.4 的释放动力学——抗体半衰期的体外代理指标。
材料
- Biotinylated FcRn（FCGRT & B2M 异二聚体），QC：SEC ≥95% 单体、内毒素 ≤0.1 EU/µg
- Streptavidin 传感器/芯片（SPR 或 BLI）
- 运行缓冲液（脱气、0.22 µm 过滤）：
- 缓冲液 A（pH 6.0）：50 mM 磷酸钠、150 mM NaCl、0.05% Tween-20，pH 6.0
- 缓冲液 B（pH 7.4）：50 mM 磷酸钠、150 mM NaCl、0.05% Tween-20，pH 7.4
- 分析物：单体 IgG / Fc 片段（SEC 确认）
- 阴性对照：FcRn 结合缺陷突变体（如 I253A/H310A/H435A）
操作步骤
- 低密度捕获：biotinylated FcRn 捕获于 streptavidin 表面；SPR 目标 Rmax 30–80 RU（BLI 0.3–0.8 nm）——低密度防亲合性；
- 平衡：缓冲液 A（pH 6.0）至基线稳定（≥5 min）；
- 结合：pH 6.0 下注入分析物（30–50 µL/min SPR / 100–200 rpm BLI）；浓度系列（预期 KD 上下 ~10×，2 倍稀释）；含参考通道扣减；
- 解离阶段 1（pH 6.0）：60–120 s——记录 pH6.0 的 k_off；
- pH 7.4 释放步骤：切换缓冲液 B（pH 7.4）观察释放 120–300 s——这是半衰期相关指标；
- 再生：短脉冲（10–30 s）pH 7.4 或 10 mM glycine pH 2.5–3.0（筛选前验证 ≥5 循环活性稳定）；
- 分析：pH6.0 数据 1:1 Langmuir 全局拟合（KD/kon/koff）；报告 pH7.4 解离半衰期（t½ = ln2/[email protected]）。
判读
- pH6.0 KD 越高（越弱）= 内涵体结合越弱 → 半衰期越短（多数模型）；
- pH7.4 释放越慢 = 再循环越久 → 半衰期越长；
- 候选分子与同场 WT-IgG1 对照比较。
故障排查
| 症状 | 可能原因 | 修复 |
|---|---|---|
| KD 偏紧 | 亲合性（表面密/分析物聚集） | 降密度；SEC 纯化分析物 |
| pH6.0 不结合 | FcRn 非完整异二聚体 / 缓冲液 pH 漂移 | 验证批次；重配缓冲液 A，pH 计复核 |
| 基线漂移 | 再生不足/非特异 | 加强再生；缓冲液加 BSA |
| pH7.4 释放太快测不到 | 高流速 + 快 off-rate | 释放时降流速；Rmax 微升（保持 <100 RU） |
参考文献
- Roopenian DC, Akilesh S. FcRn: the neonatal Fc receptor comes of age. *Nat Rev Immunol.* 2007;7(9):715–725.
- Raghavan M, Bonagura VR, Morrison SL, Bjorkman PJ. Analysis of the pH dependence of the neonatal Fc receptor/immunoglobulin G interaction using antibody and receptor variants. *Biochemistry.* 1995;34(45):14649–14657.
- Vaccaro C, Zhou J, Ober RJ, Ward ES. Engineering the Fc region of immunoglobulin G to modulate in vivo antibody levels. *Nat Biotechnol.* 2005;23(10):1283–1288.
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